B - Les différentes méthodes d'amplification

Il existe trois types de méthodes pour amplifier les séquences non codantes :

-         La méthode PCR

-         La méthode RFLP

-         La méthode ACP d’AFLP

La méthode la plus utilisé est la méthode PCR

La méthode PCR

      La méthode PCR a été inventé en 1983 par un chercheur californien en biotechnique appelé Karry Mullis. PCR est l’abréviation anglaise de ‘Polymerase Chain Reaction’ ce qui signifie réaction de polymérisation en chaine. C’est une technique de développement enzymatique qui permet à partir d’un échantillon d’Adn, d’obtenir plusieurs millions de copies identiques de ce même échantillon. Elle permet le séquençage des génomes, la détection des maladies génétiques, l’étude de l’ADN fossile, la détection des O.G.M et est au service de la police scientifique. La technique connaît un progrès à partir de la commercialisation, d'une ADN polymérase résistante aux températures élevées (la Taq polymérase), qui permet une rationalisation de la technique.

 


  La technique de la PCR se fait en plusieurs cycle, chaque cycle sa fait en trois étapes. 

Avant la réaction, dans un même tube l’ADN à amplifier, les oligonucléotides, caractéristique du segment d’ADN voulu, de l’ADN polymérase et enfin le mélange des quatre désoxyribonucléotides constitutifs de l’ADN. 

La séquence cible représente  le segment d’ADN qui sera amplifié. Celle-ci est déterminée lors du choix du couple d’amorces.

 

Le couple d’amorces doit tenir compte de plusieurs paramètres au même temps. L’ADN initial peut être beaucoup plus longue  des 2 part de la séquence, c’est pourquoi chaque brins d’ADN est marqués par des extrémités  5-prime et 3- prime.

Début des cycles : chaque cycle est constitué de 3 étapes différentes à température différentes.

Dénaturation, hybridation et enfin l’élongation.

1er cycle :

 

Nous sommes à la première étape .le thermomètre  indique que le tube est à la température ambiante celle du thermocycleur.

Quand on chauffe à 95° C, les liaisons qui assuraient la cohésion de la double hélice d'ADN se rompent  pour donner deux simples brins d'ADN. 

Puis on passe à la deuxième étape  l’hybridation. 

L’hybridation des amorces sur l’ADN repose sur le principe de l’accord des bases complémentaires.

La température de l’hybridation est inférieure à celle de la dénaturation, cette température résulte d’un compromis entre plusieurs paramètres. Elle est calculée en fonction de la longueur et de la séquence des amorces.

Enfin on passe à la dernière étape l’élongation.

  Les amorces hybridées à l'ADN servent de point de départ à la polymérisation du brin d'ADN complémentaire de l'ADN matrice. La polymérisation se fait par ajout successif des désoxyribonucléotides. Chaque base ajoutée est complémentaire de la base correspondante du brin matrice. 

    Les ADN polymérases sont des enzymes qui synthétisent l'ADN de l'extrémité 5-prime vers l'extrémité 3-prime. Les polymérases utilisées en PCR sont extraites de bactéries vivant naturellement à des températures élevées comme les sources hydrothermales du fond des océans. Ces polymérases ne sont pas dénaturées par la chaleur. La plus connue est la Taq polymérase.

Dans les prochains cycles les 3 étapes se répètent et à chaque fois les brins se multiplient.

 

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